實驗原理：

細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細(xì)胞能繼續(xù)生長，同時也將細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)大，須進(jìn)行傳代再培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)也是一種將細(xì)胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細(xì)胞直接分瓶就可以，而貼壁細(xì)胞需經(jīng)消化后才能分瓶。

實驗材料與儀器：

1、需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞

2、0.25％ yidanbaimei工作液；RPMI 1640 培養(yǎng)基（含 10％ 小牛血清）

3、倒置顯微鏡，CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱、吸管、培養(yǎng)瓶/皿、 超凈工作臺、封口膜、酒精

實驗步驟

貼壁細(xì)胞：

1、材料選取與漂洗

選取生長密度 80%左右即處于生長對數(shù)期的HeLa細(xì)胞，在超凈工作臺中操作，吸去培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，加入1-2 mL的PBS溶液，輕輕潤洗，漂洗細(xì)胞以除去殘留的血清。

2、yidanbaimei消化

向培養(yǎng)皿中加入足以覆蓋細(xì)胞層的0.25%yidanbaimei消化液（約1-2 mL）。將培養(yǎng)皿置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中孵育 2-3分鐘（消化不夠，可適當(dāng)延長時間）。倒置顯微鏡下實時觀察，大部分細(xì)胞形態(tài)變圓切邊緣透亮?xí)r，加入等體積含10%血清的wanquan培養(yǎng)基以終止消化反應(yīng)。

3、細(xì)胞懸液制備與離心

用移液槍輕柔吹打細(xì)胞使其成為細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，室溫，1000 rpm，離心 5 分鐘。

4、重懸與分盤

離心后，用吸引器輕輕吸去上清，加入1mlwanquan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1皿細(xì)胞傳2皿或3皿比例進(jìn)行傳代（不同細(xì)胞特性不同，分盤比例適當(dāng)調(diào)整），將1皿細(xì)胞的細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

5、標(biāo)記與培養(yǎng)

接種好后，在新的培養(yǎng)器皿上標(biāo)記好細(xì)胞名稱、傳代代數(shù)、操作日期及操作者姓名。輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移至37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

6、觀察

培養(yǎng)24小時后，依據(jù)培養(yǎng)基pH指示劑顏色變化（如酚紅）及細(xì)胞生長密度，決定后續(xù)操作：更換新鮮培養(yǎng)基、繼續(xù)進(jìn)行傳代或執(zhí)行細(xì)胞凍存。

懸浮細(xì)胞或半貼壁細(xì)胞

1、制備細(xì)胞懸液

取狀態(tài)良好的細(xì)胞，在生物安全柜中操作，用移液管把細(xì)胞輕柔吹打均勻。

2、離心

把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，1000 rpm離心5 min。

3、重懸

輕輕吸去上清后用wanquan培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1皿細(xì)胞傳2皿或3皿比例進(jìn)行傳代，把細(xì)胞懸液一分為二或者一分為三后分別轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。

4、標(biāo)記與培養(yǎng)

接種好后，在新的培養(yǎng)器皿上標(biāo)記好細(xì)胞名稱、傳代代數(shù)、操作日期及操作者姓名。輕輕搖勻后轉(zhuǎn)移至37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

5、觀察

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細(xì)胞的生長密度進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)的操作（更換新鮮培養(yǎng)基或者再次傳代處理或者進(jìn)行凍存處理）。